Influence des conditions de culture sur le phénotype d'une levure Ade 2

par Didier Prévost – lycée Guy Mollet Arras – avec la collaboration de Marc Unal – lycée Montebello Lille -

Objectif de la manipulation	Première S : L’effet des allèles d’un gène va dépendre également de l’environnement.
Principe de la manipulation	Placer des Levures Ade2 de couleur rouge dans un milieu pauvre en dioxygène.
Matériel	- Souche Ade2 de couleur rouge et boîtes de Pétri stérilisées renfermant une gélose nutritive spécifique (cf. TP Seconde – Kit mutagenèse de Sordalab) - Chiffon imbibé d’eau de Javel et savon - Bec Bunsen ou bec électrique - Tubes et pipettes stériles nécessaires à la dilution - Scalpel et öse stérilisés - Etuve
Réalisation technique	A préparer avant la séance : - Prélèvement de Levures Ade2 - Mise en solution en milieu stérile - Comptage sur cellule de Malassez ou lame de Kova - Correction de la concentration par dilution (cf. fiche technique fournie par Sordalab) Lors de la première séance : - Ensemencer une boîte de Pétri en milieu stérile avec la suspension de Levure Ade2 préparée par l’enseignant - Découper, près du bec, un carré de gélose à l’aide du scalpel stérile dans la boîte ensemencée (ou dans une autre boîte stérile). - Toujours près du bec, basculer à l’aide du scalpel le carré découpé sur le reste de la gélose puis appuyer délicatement sur ce carré pour assurer un bon contact avec la surface du milieu - Mettre en culture 7 jours à 28°C Lors de la deuxième séance : - Observer les colonies de Levures sous la gélose (manque d’O₂) et les colonies à la surface du milieu laissé à l’air libre (témoin). - Retourner la boîte et marquer en pointillés l’emplacement du carré de gélose. Enlever ensuite délicatement le carré de gélose et observer dans les heures qui suivent.
Résultats (cf. photos ci-dessous)	Les Levures Ade2 placées en aérobiose apparaissent rouges, car l’AIR (phosphoribosyl aminoimidazole) accumulé suite à l'interruption de la chaîne de biosynthèse de l'adénine est oxydé en un pigment rouge. Sous la gélose placée sur le milieu, il y a un manque de dioxygène surtout dans les zones où le contact est étroit : l’AIR formé dans les levures Ade2 n’est plus totalement oxydé, celles-ci présentent alors un phénotype original : une couleur rose. En retournant la boîte de Pétri, vous pourrez également observer cette couleur rose pour les Levures situées à la base des autres colonies Ade2, là où règne un déficit en dioxygène. Lorsque le carré de gélose est enlevé, les colonies roses sont placées en aérobiose et prennent alors une coloration rougeâtre dans les heures qui suivent.
Remarques et astuces	- L’obtention d’une anaérobiose parfaite est difficilement réalisable. Dans ce cas, elle aboutit à une absence totale d’oxydation de l’AIR en pigment rouge : les colonies sont alors de couleur crème. Outre cette difficulté, il y a un risque de confusion pour les élèves entre ces Levures Ade2 en anaérobiose et les révertants Ade2 ayant subi une mutation spontanée. Il est donc préférable de ne considérer que les colonies roses. - Le prélèvement du carré de gélose dans une boîte non ensemencée puis son dépôt dans la boîte ensemencée donnent un résultat plus « esthétique », mais constituent des opérations beaucoup plus délicates pour l’élève.